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无血清培养基的开发
点击次数:65 发布时间:2019-09-10

要开发无血清培养基,关键是找出血清中支持细胞生长的所有成分。其必要性在于有些细胞非常挑剔,同时要注意不同细胞系的营养需求差别较大。因此,不可能设计出一种适合所有细胞系的通用培养基。事实上,即使是同一细胞系,其内部的不同克隆,营养需求也存在差异。

 

无血清培养基存在如下几种:化学限定培养基所有成分均知其化学结构,它可包含蛋白质。无蛋白培养基则不包含大分子蛋白,其成分可能并非化学限定。无动物源培养基也可能不是化学限定的,它只是不包含动物来源的成分。理想的培养基是化学限定的无蛋白、无动物源成分培养基。但经常发现,随着成分限定性的增加,培养基的性能则不断下降。

 

无血清培养基的开发有从上至下法和从下至上法。从上至下法是为类似细胞系选择已知配方的培养基,添加血清,使细胞达到最大生长。再逐步减少血清,使细胞生长速率降至原先的50%。这时再选择性地加入某些成分,使细胞恢复生长至原先水平。

 

该方法较为简易。属于同一类别的细胞系经常需要同一生长因子。因此,对一种上皮细胞系有效的配方对另一种上皮细胞系,可能只需做极小的调整。用该方法开发配方较为容易。该过程也涉及细胞的驯化,其中细胞会自身合成一些必需组分。该方法的缺点是可能存在很多非必需成分,有些成分还会抑制生长。

 

另一种方法是从下至上法。它系统加入可能促生长的组分,使细胞生长逐渐升高。这样只有生长必需的成分才会留在配方内。用该方法开发的培养基能使细胞具有更高的生长速率,并且更容易获得改进。

 

 

图. 确定一个成分的浓度

 

此外,统计法也常用于无血清配方的开发。

 

目前已知取代血清的能够促细胞分裂的成分有:蛋白水解物(动物蛋白、植物蛋白或菌体蛋白)、胰岛素和胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子、转铁蛋白、黏附因子等。

 

在蛋白水解物中,酵母、大豆、小麦、棉花、豌豆水解物已经广泛使用。但水解物成分较为复杂,有人用HPLC和质谱分析大豆水解物410种成分中,253种为多肽。要实现细胞的生长,常非单一使用水解物,而需要多种组分的搭配。同时,同一水解物批次之间存在一定的组成差异,用NMR指纹图谱可进行批间一致性和产品质量的预测。

 

胰岛素是5.7KD的多肽,许多细胞需要。它可刺激细胞DNA的合成。目前,有重组胰岛素可添加至无动物源培养基配方中。IGF与胰岛素接近,但促细胞分裂活性更强。

 

总之,目前已有商品化的无血清培养基,可用于细胞无血清或无动物源环境的培养,只是其配方大多保密。

 

在最近新出的无血清培养基产品中,HiMedia公司开发的CELLin1TM值得关注。它是一款化学限定的无动物源成分的病毒生产用培养基,主要适合肾细胞系如Vero细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、PK-15细胞系和人胚肺二倍体MRC-5细胞系。以MDCK细胞系为例,初始接种密度为0.3-0.5×106个细胞/ ml,培养48~72小时后,细胞密度可达约3.1×106个细胞/ ml,流感病毒A的滴度可达约5.0 log10TCID50。细胞可稳定传代,密度可保持在3.0~3.4×106个细胞/ ml,保证种子细胞的制备。

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