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叶酸测定用培养基的原理
点击次数:56 发布时间:2018/5/8

正常人的血清叶酸水平正常为9.9ng / ml。在身体异常或得病时,叶酸水平会显著变化。叶酸干酪培养基采用干酪乳杆菌(ATCC 7469)为测定用菌,用于叶酸的微生物法测定。该培养基是基于Flynn等人(1)的配方,并经Baker等人(2)和Waters、Mollin(3)改良。用于维生素测定的测定菌通常需要三种培养基:维持培养基、接种培养基和测定用培养基。后者通常是化学限定的培养基,包含所有测定菌生长所需的养分,但不含有待测的分子。类似的,叶酸干酪培养基包含干酪乳杆菌生长所需的所有成分,但不包含叶酸。因而,添加一系列浓度增加的叶酸,会观察到干酪乳杆菌生长反应的递增。

 

干酪乳杆菌(ATCC 7469)的贮备菌制备是在AOAC推荐的乳杆菌琼脂(货号M366)试管穿刺接种培养,35-37°C孵育18-24小时后,试管储存在冰箱里。每月转接一次。测定菌液的制备是将贮备菌转种到含10ml微量维生素检测接种肉汤(货号M133)或乳酸杆菌肉汤(货号M367)的试管中。35-37°C孵育24小时后,在无菌条件下菌液离心,弃掉上清,再重悬于10ml的无菌叶酸干酪培养基中(货号M543)。再像之前一样沉淀,并清洗一次。最后,清洗后的菌株重悬于10ml叶酸干酪培养基中,并用该培养基进行1:100稀释。1滴重悬液用于接种到每个测定管中。也可用0.85% NaCl代替培养基来清洗和稀释。

 

由于灭菌条件,孵育温度等因素会影响标准曲线读数,并且每次不会完全一样,因此每次都应制备标准曲线。10ml管内的标准品量为0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1ng。

 

叶酸标准品的制备:将20mg叶酸干粉溶于含有20ml乙醇的100ml蒸馏水中。用0.1N NaOH调整溶液pH值为10.0,再用0.05N HCl调pH为 7.0。该溶液含有200g叶酸/ml。用999ml蒸馏水稀释1ml该溶液,则浓度为200ng/ml。再用999ml叶酸缓冲液A(货号M544)稀释1ml该溶液,则为0.2ng/ml的叶酸标准溶液。每管取0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0和5ml该溶液,配置即告完成。

 

血清样本的保存:让血液样本凝固以分离血清。分离血清至干净干燥的血清管,并离心除去存在的任何血细胞。小心操作,避免出现红细胞的溶血。分装血清样本至于干净干燥的试管中,每管5ml。每管加入25mg的抗坏血酸。-20°C以下温度保存。

 

血清样本的制备:解冻含有抗坏血酸的血清。向5ml样品中加入45ml叶酸缓冲液A(M544)。孵育37℃90分钟。然后15磅121℃高压灭菌2.5分钟。离心去除凝固的蛋白,将上清液转移至清洁干燥的管中。该透明溶液即可用作叶酸待测的样本。

 

样本叶酸浓度的测定步骤:如前所述使用0.5,1.0,1.5ml或其他体积的制备好的血清提取物。加入5ml叶酸干酪培养基和足量的蒸馏水,使每个试管的总体积为10ml。15磅121°C灭菌5分钟。冷却试管并向每个试管中加入一滴接种液。35-37℃孵育18-24小时后进行浊度读数。读数前将试管冷藏15-30分钟以停止细菌生长。620nm检测吸光度。待测样品中的叶酸含量应根据标准曲线来确定,不过要考虑样品稀释度。

 

应非常小心,避免培养基和玻璃器具被污染。应使用洁净的无去污剂的玻璃器具。少量的外源物质的污染可能导致错误的结果。

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