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支原体PCR检测培养方法检测结果
点击次数:141 发布时间:2018-02-06
  支原体PCR检测培养方法检测结果
  
  支原体PCR检测直接培养法
  
  原理:直接培养支原体于培养基中,观察其生长及菌落生成。
  
  特点:是目前zui直接与灵敏之步骤,亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
  
  缺点:培养时间长,须3-5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来(例如M.hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组,可能会造成污染。
  
  材枓:dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸(厌氧缸长期培养易有污染,所以厌氧包应用无菌水,每次打开厌氧缸后,用70% ethanol擦拭内壁。)
  
  污染是细胞培养的大敌,预防和避免污染是成功培养细胞的关键之一。危机意识要贯彻实验的始终,否则不仅浪费时间,而且浪费人力、物力,甚至造成无法弥补的损失。
  
  支原体PCR检测方法与结果:
  
  1,将已检测出有支原体污染的细胞以正常传代密度铺到6孔板中,一个孔加清除剂,作为测试孔,另一孔不加清除剂,作为阴性对照孔。两孔之间间隔一个孔,以免互相污染。
  
  2,在清除支原体的过程中细胞以常规方法传代培养,并使细胞在培养过程中一直处于清除剂的作用下。在加清除剂后第4、8、9、11天各取1毫升培养上清。每份上清与细胞已共培养48小时,除第9天的上清只共培养了24小时。
  
  3,将这些培养上清在16000g离心5分钟,小心去除离心上清,将沉淀用无菌PBS洗三次,每次以16000g离心5分钟。zui后获得的沉淀用100微升纯水重悬,在100℃水浴中孵育5分钟,然后用于PCR反应。
  
  4,按照支原体检测试剂盒的说明书进行PCR检测操作,结果如下:
  
  4.1,与对照样品共同反应,用这种方式可以判断是否出现了假阴性结果。在加清除剂后第4天的样品中仍可见到支原体阳性条带(约440bp),在第8、9、11天的样品中,已看不到支原体阳性条带。
  
  4.2,不加对照样品,检测样品单独反应,用这种方式可以提高测试灵敏度。可见在第8天和第9天的样品中,支原体阳性条带仍然出现,但是弱于第4天的样品。在第11天的样品中,有明显的200bp以下的非特异的条带,且亮度高于阳性条带,所以判断此时的PCR产物是非特异反应的产物,样品中已没有支原体DNA。
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